題:
課堂上最好的miniprep協議是什麼？
shigeta
2011-12-15 04:39:07 UTC
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我正在努力尋找質粒小量製備的良好方案，我正在尋找3種製備物：

  1. 使用苯酚/氯仿
    • 用苯酚：氯仿：異戊醇萃取，
    • 異丙醇沉澱，12,000g離心分離，
    • 用冷的70％乙醇沖洗。
  2. 將溶菌酶
    • 溶菌酶與溶菌酶一起使用，
    • 去除沉澱物，
    • 異丙醇沉澱，
    • 用冷的80％乙醇洗滌。
  3. 使用鹼裂解法
    • 打開含EDTA緩衝液中80％葡萄糖的細胞，
    • 添加SDS和NaOH，
    • 顆粒蛋白/膜和乙酸/乙酸，
    • 異丙醇沉澱， li>
    • 用70％的冷乙醇洗滌。
    4. ol>

    它們在打開細胞以及將質粒與其餘細胞分開的方式上都不同-相當多。誰能幫我找出最適合的協議？

您確定要讓學生使用苯酚嗎？大多數實驗室可能會使用試劑盒進行DNA提取（例如Quiagen MiniPrep）。這更容易，也更安全。
我將把Reven的答案標記為最好的，因為它可以幫助我在協議中選擇最多。但是感謝您指出qiagen套件的便宜程度-我認為它們要差得多。您確實可以通過使用協議來學到一些東西，但是專欄很簡單！
FYI的實際值約為每旋轉製備柱1-2美元，但SDS / NaOH試劑的製備成本約為40美分。您必須做100多次準備才能看到節省的費用。
只是想更新一下我是從biobasic購買的色譜柱，雖然它不像這些基本規程那樣具有指導意義，但它們肯定足夠便宜，應該在課堂上考慮使用-全面支持。
@MadScientist Spin色譜柱確實是最常見的選擇，但從教學角度講：遵循試劑盒手冊並沒有太多要學習的知識，但是PCI萃取技術可以教一些重要的生物化學。即使使用離心柱進行常規純化，當您碰巧被卡住時，PCI也可能是寶貴的後備，因為某些雜質會不斷穿過您的色譜柱。
最後，我談到了旋轉準備的每個步驟做了什麼，並且效果很好。當您談論改變矽膠上的pH親和力等方法時，舊方法實際上並不十分嚴格
五 答案:
Nick T
2011-12-15 05:09:02 UTC
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我在遺傳學實驗室課程中使用的方案是鹼裂解，然後乙醇沉澱與此類似。沒什麼大毒的，也不需要通風櫥（至少要使用很小的體積）。

更實用，更可靠的方法是使用幾個供應商之一的miniprep試劑盒（通常是旋轉柱）（ Qiagen， Promega， Bio-Rad等），價格相當便宜，每次準備1-2美元。

如果我沒記錯的話，鹼裂解法是Qiagen DNA純化試劑盒（微量製備等）的基本方法。使用試劑盒中的旋轉柱，您可以減少酒精的沉澱和乾燥。聽起來可能並不多，但是值得付出這個套件的價格，因為它消除了協議中超過10分鐘的時間和敏感步驟。我的兩分錢：您不想在教室裡使用苯酚。
我使用的所有製備試劑盒（Qiagen，Promega，Invitrogen）均使用鹼裂解法。我之所以喜歡這些色譜柱，是因為不必擔心完全蒸發掉所有乙醇（我將它們與真空歧管一起使用，所以我吸了一兩分鐘使它全部蒸發）或尋找一些半隱形的沉澱。
一旦我在Open Wet Ware上找到了qiagen食譜，就更喜歡這個了。
yamad
2011-12-22 15:13:24 UTC
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我認為旋轉柱套件是必經之路。如前所述，試劑盒的好處在於它們簡單，安全，並且（最重要的是）這些天幾乎每個實際實驗室都進行質粒純化。

對商業工具包的最大批評是，您可以輕鬆地獲得解決方案，而無需了解試管中實際發生的任何事情。但是，正如對Nick T的答复的評論所指出的那樣，試劑盒中沒有秘密的專有技術-它們使用了鹼裂解方法。這意味著您仍然可以在課堂上教授該機制，同時獲得旋轉柱的好處。

出於教學目的，一個選項是製作所有自己的解決方案，而僅在旋轉柱上使用沉澱沉澱的膜/蛋白質後上清液。這樣，您將獲得堅持使用溶液真實名稱的好處（NaOH比P2更具教育意義），並且可以使用旋轉柱代替乙醇沉澱。我相信有便宜的貨源只出售旋轉柱，儘管我從未使用過。您要避免乙醇沉澱，因為它至少會增加30分鐘的實驗時間（對於我的實驗方案而言，它更像是1.5個小時或更長時間）。等待乙醇蒸發以便重新懸浮，就像看著油漆變乾，除非您有真空排氣。

在課堂上情況下產量不應該是大問題，但是您可以通過色譜柱提高產量通過延長最終洗脫步驟。我認為給出的指令是讓TE緩衝區（Tris）在最終旋轉之前“洗脫” 1分鐘，但是我通常讓TE靜置15-30分鐘，然後旋轉下來。產量的差異使膠卷相機的曝光消失。

在某些情況下，仍需要進行苯酚：氯仿萃取，但這絕對不是其中一種。在處理RNA和酵母基因組DNA時，我通常會定期進行P：C。我從來沒有見過在製備質粒時除了miniprep以外的任何其他方法。而且，在通風櫥中工作的麻煩以及苯酚燃燒的風險促使實驗室的很多人甚至在使用基因組DNA時也更喜歡旋轉試劑盒。

經過一些努力，我們確實轉向了旋轉套件...
Reven
2011-12-15 05:52:23 UTC
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以我的經驗，P：C：I方法將為您帶來更高的產率，並且更簡單（涉及的步驟和化學方法），但是正如@Mad Scientist所說，酚的使用可能是一個問題。這取決於學生的年齡。

這不僅是學生的年齡，還取決於可用的設施。例如，您確實需要遮光罩，並且需要提供苯酚處理服務。
苯酚和氯仿具有劇毒和致癌性，學生或在適當的通風櫥內絕對不能使用。
user91
2011-12-15 06:47:21 UTC
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我的教授和我使用旋轉柱在幾個小時內從大約30個樣品中提取了大約30個質粒。它容易，便宜，並能產生高質量的質粒。我的樣品通過紫外光譜進行了定量，約為200ng / ul。

George
2014-02-01 08:25:24 UTC
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為節省成本，您可以單獨從Syd Labs（ http://www.sydlabs.com/spin-column-for-plasmid-miniprep-p110.htm ）並製作自製緩衝區。供應商通常提供緩衝配方。



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