題:
CRISPR / cas9切割後如何編輯/插入新基因
joe
2016-08-09 20:21:40 UTC
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我是一個開始學習CRISPR / Cas9的學生。據我了解，CRISPR / Cas9是一種酶，用於切割特定序列的基因。我想知道科學家下一步將如何插入/編輯基因組。

例如，說我有一個原始序列... AAATTT ...我可以插入一個新序列嗎？序列變成中間，這樣就變成了：... AAA GCGCGC TTT ...？還是我可以像這樣編輯序列的單個核苷酸：... AA C TTT ...？

如何在切割處插入新序列地區？是否需要任何酶才能使它們彼此結合？如何確保序列不會在錯誤的位置插入或連接？

HTTPS://有圖.不餓/2品牌17E4E-O8?他=1沒50是
@Dale感謝您觀看此視頻，我看了一下視頻，但並不清楚，這是否意味著切成粘性的末端而不是鈍的末端，我們需要設計粘性的寡聚核苷酸，以便它們可以彼此結合嗎？正如我在視頻中看到的那樣，將它們連接在一起不需要酶。您能再解釋一下嗎？
@Dale正如我所知，要將2個粘性末端dna連接在一起，似乎我們需要使用一種稱為“ dna ligase”的酶，不是嗎？
二 答案:
canadianer
2017-02-07 05:25:50 UTC
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Cas9用於在基因組DNA中創建雙鏈斷裂（DSB）。然後，該單元可以使用同源性定向修復（HDR）修復斷裂。該細胞還可以使用非同源末端連接（NHEJ）修復DSB，但這對於插入特定序列沒有用。在HDR中，將與斷裂位點任一側同源的序列用作模板，以便斷裂可以無錯誤地修復。自然地，同源模板可以是同源染色體，也可以是斷裂染色體的複制副本。

但是，請考慮將DNA引入到具有與斷裂位點同源的區域以及任何其他序列的細胞中的情況。 s）您要插入/刪除/更改。在這種情況下，可以使用此外源DNA作為模板修復斷裂，然後將您的更改整合到基因組中。

還有其他將位點特異性DSB引入基因組的方法，例如 TALENs。 CRISPR / Cas9的最大優點是位點識別是通過RNA而不是蛋白質進行的（合成小RNA比製造大蛋白要容易得多。

儘管此答案涵蓋了OP的所有要點，但還是有必要指出更多細節。 （即HDR需要哪些蛋白質或成功整合靶標的概率）
@Nicolai更詳細的信息總是很不錯的，但是，由於對該問題和答案缺乏興趣，因此我不確定是否有必要。如果您需要添加更多信息，建議您發布自己的答案或編輯此答案。
Dale
2016-08-09 22:53:18 UTC
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有多個Cas9蛋白，因此許多信息是特定蛋白特異的。

在CRISPR切割的位置插入基因絕對是可能的-當然，這需要其他蛋白質。細胞通常含有這些蛋白質，因此從技術上講，插入序列末端的互補序列是插入細胞內所需的全部。所有這些都有很多細節，但這不是您的問題要問的。

最近已編輯了單點突變：但是它不在單元格內： https://www.statnews.com/2016/04/20/clever-crispr-advance-unveiled /



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